Pembuatan Insulin dengan Bakteri Escherichia Coli

 A. Bakteri Escherichia coli

Bakteri Escherichia coli atau yang lebih dikenal dengan bakteri E. coli adalah bakteri yang umumnya sering ditemukan di dalam usus manusia ataupun hewan. Bakteri ini diberi nama dari seorang bacteriologist yang berasal dari Jerman yaitu Theodor Von Escherich. Dr. Eschesrich merupakan orang yang pertama kali berhasil mengisolasi bakteri tersebut. Dr. Escherich juga berhasil membuktikan bahwa diare dan gastroenteritis yang terjadi pada infant adalah disebabkan oleh bakteri Escherichia coli (Jawetz dkk, 1995). 


E. coli biasanya tumbuh di tanah dan di usus besar banyak mamalia, termasuk manusia. Sebagian besar strain E. coli tidak menyebabkan penyakit, ada bakteri E. coli yang berguna untuk membantu hewan mendapatkan vitamin dan mencerna makanan. Beberapa strain E. coli menyebabkan penyakit pada manusia seperti penyakit diare dan lainnya. Strain adalah koloni mikrobia dengan sifat-sifat fisiologi yang sama sebagai hasil proses isolasi atau rekayasa lainnya untuk memurnikan sifat itu (Wikipedia). E. coli biasanya tidak ada dalam makanan atau air kecuali jika makanan atau air tersebut telah terkontaminasi dari luar, ada kemungkinan bahwa bakteri E. coli ada di dalam makanan atau air yang terkontaminasi tersebut. Diantara banyak strain E. coli, hanya beberapa yang menjadi pemicu diare. Salah satu kelompok E. coli - yang termasuk O157: H7 - menghasilkan racun kuat yang merusak lapisan usus halus, yang dapat menyebabkan diare berdarah. Ada kemungkinan akan mengalami infeksi E. coli ketika menelan jenis bakteri ini. 

Tidak seperti banyak bakteri penyebab penyakit lainnya, E. coli dapat menyebabkan infeksi walaupun hanya tertelan sedikit. Karena hal ini, seseorang bisa sakit oleh E. coli karena makan daging yang sedikit matang atau menelan seteguk air  yang terkontaminasi.

Bakteri E. coli ini tumbuh pada suhu antara  10-45°C, dengan suhu optimumnya  sekitar 37°C, pH optimum  untuk pertumbuhannya  adalah 7-7,5, pH minimum 4 dan pH maksimum 9 (Faridz dkk, 2007). Bakteri yang dipelihara di bawah temperatur minimum atau sedikit di atas temperatur maksimum, tidak akan segera mati melainkan berada di dalam keadaan tidur atau dormansi (Melliawati, 2009).

Bakteri E. coli juga bisa digunakan sebagai memproduksi insulin untuk mencegah penyakit diabetes melitus. Bakteri ini dipilih karena rentang umur yang pendek, jumlah generasi yang banyak, susunan genetik bakteri lebih mudah dimodifikasi, lingkungan luar dapat dimodifikasi ekspresi gen, menghasilkan produk hampir mendekati yang kita inginkan (menyerupai insulin hasil sekresi β-pankreas) serta lebih ekonomis (Esha, 2011). B. Insulin

Insulin merupakan suatu hormon polipeptida yang disintesis dan sekresi dari sel β-pankreas untuk pengaturan kadar glukosa dalam darah. Hormon insulin berperan dalam menjaga keseimbangan gula dalam darah melalui metabolisme penyediaan tenaga dari glukosa,  mengarahkan glukosa dalam darah agar menuju organ tertentu seperti otot, lemak, dan hati, serta berperan dalam proses metabolisme karbohidrat, lemak dan protein (Espinal, 1989).

Gambar 1. Insulin

Molekul insulin terdiri dari 51 asam amino dengan berat molekul 5802, dan titik isoelektrik pada pH 5,5. Asam amino dari insulin terbagi menjadi dua rantai yaitu rantai A dan rantai B. Rantai A (berwarna biru pada Gambar 2) terdiri dari 21 asam amino dan rantai B (berwarna kuning pada Gambar 2) terdiri dari 30 asam amino. Kedua rantai tersebut dihubungkan oleh jembatan disulfida. Insulin yang telah disekresikan akan menempel pada reseptor glikoprotein yang berada pada permukaan sel yang ditargetkan. Reseptor glikoprotein terdiri dari sub unit α dan β. Subunit α pada reseptor glikoprotein akan mengikat hormon insulin sedangkan sub unit β akan membantu metabolisme penyediaan tenaga (Wilcox, 2005).

Struktur kimia dari Insulin Manusia beserta bentuk 3D nya
Gambar 2. Struktur kimia dari Insulin Manusia beserta bentuk 3D nya (Patel dkk, 2008)


Insulin memiliki peran yang sangat penting dan dapat menentukan kadar glukosa dalam darah melalui metabolisme penyediaan tenaga. Karbohidrat dalam tubuh akan dicerna dan  diubah menjadi glukosa. Glukosa tersebut kemudian diserap oleh usus-usus halus dan dialirkan dalam darah manusia. Glukosa dalam darah tersebut dapat memicu sekresi hormon insulin. (Cheatham, 1995). Hormon insulin selanjutnya akan membantu metabolisme konversi glukosa dalam darah menjadi energi dan cadangan energi dalam bentuk protein maupun lemak. Dengan adanya konversi glukosa menjadi energi tersebut, maka kadar gula dalam darah dapat turun. 

Ketidakadaan hormon insulin akan menyebabkan kadar glukosa dalam darah tinggi karena tidak adanya metabolisme konversi glukosa menjadi energi sehingga glukosa dalam darah akan menumpuk. Kadar gula dalam darah yang tinggi akan menyebabkan kencing yang terus menerus, akibatnya tubuh menjadi kurang cairan dan merasa sering haus. Sel-sel tubuh yang kekurangan pasokan energi  akan menggunakan cadangan lemak untuk memenuhi energi yang dibutuhkan. Apabila hal tersebut berlangsung terus menerus dapat mengakibatkan hati memproduksi keton. Keton dapat meracuni dan membunuh sel dalam jangka waktu lama dan dapat berujung pada penyakit serius bahkan koma (Lanywati, 2001).

Meskipun sel β pankreas telah memproduksi hormon insulin namun ada beberapa kondisi yang memungkinkan tubuh mengalami kekurangan insulin atau bahkan tubuh tidak dapat memproduksi insulin. Hal tersebut dapat disebabkan oleh faktor genetik maupun dari faktor gaya hidup yang tidak sehat. Kekurangan hormon insulin menyebabkan hiperglikemia yang lama kelamaan dapat berujung diabetes melitus. 

Salah satu penanganan dari kondisi dimana tubuh kekurangan insulin adalah dengan menyuntikkan insulin. Hipotesis mengenai keberadaan insulin pertama kali, pada tahun 1889, merupakan hasil dari eksperimen terhadap hewan yang kemudian mengarah pada pengembangan mengenai penyakit diabetes. Hipotesis tersebut menyatakan mengenai adanya zat yang disekresikan oleh pankreas dan bertanggung jawab dalam pengaturan metabolisme, yang kemudian pada tahun 1922 dinamakan insulin. 

Pada tahun 1991, insulin mulai diisolai dan dipurifikasi. Ekstrak insulin pertama kali di uji coba-kan untuk anjing yang menderita diabetes. Selama pengamatan, ekstrak insulin mampu mengembalikan metabolisme penyediaan tenaga dari glukosa yang dapat menurunkan kadar gula dalam darah dan menghilangkan keton. Uji coba insulin pada manusia pertama kali terjadi pada Januari 1922 pada anak laki-laki berumur 14 tahun yang menderita diabetes. Produksi insulin secara komersial terjadi mulai pada tahun 1923 dengan menggunakan insulin hewan seperti babi atau sapi yang kemudian di purifikasi melalui presipitasi isoelektrik. Namun seiring berjalannya waktu ternyata insulin yang berasal dari hewan menyebabkan alergi dan komplikasi sehingga produksinya menurun. Metode produksi insulin terus berkembang hingga pada tahun 1980-an insulin mulai disintesis melalui rekayasa rekombinan DNA dan bakteri E. Coli (Wilcox, 2005).

C. Proses Pembuatan Insulin

Pembuatan insulin dari bakteri Escherichia coli merupakan salah satu contoh penerapan rekayasa genetika. Rekayasa genetika atau manipulasi gen sendiri adalah pembentukan kombinasi baru materi yang dapat diturunkan dengan melakukan penyisipan (insertion) molekul-molekul asam nukleat, yang dihasilkan dengan cara apa pun di luar sel, ke dalam virus, plasmid bakteri atau sistem pembawa lainnya yang memungkinan terjadinya penggabungan ke dalam organisme secara tidak alami tetapi selanjutnya mampu melakukan penggandaan lagi (Old dan Primrose, 1989). Sebagian besar rekayasa genetika menggunakan plasmid. Plasmid adalah potongan DNA yang melingkar.

Menurut Godbey (2014), plasmid yang bagus memiliki beberapa elemen yang penting:

  1. Memiliki gen yang dapat ditransfer kepada sel target

Gen yang diinginkan setidaknya mengandung promotor dan ekson. Promotor berfungsi membantu memulai transkripsi pada gen. Sedangkan ekson berfungsi memasangkan polipeptida yang telah ditentukan. 

  1. Penanda resistensi antibiotik

Penanda resistensi antibiotik adalah gen bakteri yang akan melakukan seleksi ketika banyak plasmid diproduksi dalam proses yang disebut amplifikasi. Penanda resistensi antibiotik dapat menginformasikan protein mana yang akan memberikan resistensi terhadap antibiotik tertentu.

  1. Bakteri asal replikasi

Hal ini dapat memungkinkan peneliti untuk memanfaatkan E. coli untuk amplifikasi (menggunakan bakteri untuk menghasilkan banyak salinan plasmid). Prokariota seperti bakteri E. coli digunakan untuk ampilifikasi karena tidak memiliki membran inti sehingga DNA polimerase (enzim untuk mereplikasi DNA) dapat mudah dimasukkan ke dalam plasmid. Proses pembuatan insulin sendiri dibagi menjadi dua bagian yaitu upstream dan downstream.

D. Upstream Process

1. Mengisolasi DNA

Pada proses ini, molekul DNA yang mengandung insulin pada pankreas diisolasi dari sel manusia. Terdapat dua langkah utama dalam isolasi DNA ini:

  1. DNA komplementer (cDNA) diperoleh dari messenger RNA (mRNA) dua rantai menguunakan enzim reverse transcriptase.

  2. Menggandakan cDNA pada kedua rantai dengan reaksi rantai polimerase.

Pada bakteri Escherichia coli, dilakukan juga isolasi DNA yang mengandung plasmid.

2. Pemotongan DNA dan plasmid

DNA manusia yang mengandung insulin tersebut kemudian dipotong menggunakan enzyme restriction. Pemotongan juga dilakukan pada plasmid dalam sel bakteri E. coli. Pada proses ini, akan dihasilkan potongan kecil DNA dan plasmid yang terpotong.

3. Pembuatan DNA rekombinan

Potongan DNA dari sel manusia dan plasmid yang terpotong digabungkan dan dilekatkan dengan DNA ligase. Gabungan dari potongan DNA dan plasmid inilah yang disebut DNA rekombinan. 

4. Transfeksi

DNA rekombinan dimasukkan kembali ke dalam bakteri E. coli, atau biasa disebut transfeksi. Setelah itu, bakteri dibiarkan berkembang biak.

5. Penyiapan media

Larutan LB (Lysogeny broth) dibuat dari bubuk LB, kemudian di autoklaf dan ditambahkan ampisilin dan laktosa. Hal ini dilakukan untuk mensterilkan agar tidak terjadi denaturasi atau kehancuran. Sterilisasi yang dimaksud adalah suatu proses dengan metode tertentu yang memberikan hasil akhir, yaitu suatu bentuk keadaan yang tidak dapat ditunjukkan lagi adanya mikroorganisme hidup (Raudah, 2017). Sedangkan autoklaf adalah salah satu alat untuk sterilisasi menggunakan uap air yang bersuhu di atas 100°C (Burrows, 1959). Kemudian bakteri yang sudah bertransformasi diinokulasi ke dalam media. Inokulasi adalah transfer mikroba ke dalam media yang telah disterilisasi sebelumnya. Penyiapan selanjutnya adalah bioreaktor. Bagian-bagian bioreaktor diperiksa kemudian disterilkan. 

6. Fermentasi

Fermentasi dilakukan untuk memperbanyak jumlah bakteri E. coli. Dengan demikian, produksi insulin menjadi banyak. Terdapat dua stage yang dilakukan pada proses ini:

  1. Skala kecil

Pada skala kecil digunakan metode kultur perbanyakan cairan dengan shake flask yang bertujuan menyeleksi jenis bakteri yang diinginkan untuk fermentasi (bakteri yang berhasil melakukan transformasi). 

  1. Skala besar

Bakteri kemudian dipindahkan ke tangki fermentasi dan direplikasi dalam kondisi optimal. Sel bakteri akan mengaktifkan gen untuk rantai insulin manusia. Rantai insulin kemudian diproduksi di dalam sel. 



E. Downstream Process

Setelah proses fermentasi dilakukan, bakteri E. coli dikeluarkan dari reaktor untuk diekstrak DNA-nya (bagian yang mengandung insulin). Ekstraksi dilakukan dengan berbagai langkah.

1. Penambahan enzim pemecah lysosome

Penambahan enzim ini ditujukan untuk menghilangkan lapisan terluar dari sel. Enzim ini akan mencerna bagian terluar dari sel sehingga perlindungan dari sel itu telah dinonaktifkan.

2. Penambahan campuran ‘detergen’

Penambahan ini untuk meningkatkan kualitas proses menghilangkan lapisan terluar sel. Campuran ‘detergen’ akan memisahkan fatty/lemak dari membran sel.

3. Produk hasil reaktor kemudian di-treatment dengan Cyanogen bromide

Reagent ini memisahkan rantai protein (insulin) dari zat-zat lain dalam DNA. Kemudian crude rantai protein (masih dalam kondisi terpisah, antara A dan B) dipurifikasi dengan alat centrifuge dan dengan metode Chromatography seperti ion-exchange dan gel filtration untuk benar-benar mendapatkan rantai protein (A dan B) yang murni sebelum disatukan. Setelah proses ekstraksi rantai protein, hal selanjutnya yang dilakukan adalah menyatukan rantai protein A dan B. Dua rantai ini, A dan B, masing-masing membentuk ikatan disulfida dengan menggunakan sodium dithionate dan sodium sulphate. Kemudian, kedua rantai tersebut akan menyatu dengan reaksi reduksi-reoksidasi dengan senyawa beta mercaptothanol dan air oxidation dan membentuk Human Sythetized Insulin. PR-HPLC (Reverse-phase High Perfomarnce Liquid Chromatography) dilakukan untuk mengilangkan impurities dan menghasilkan pure insulin dengan kualitas tinggi. Selanjutnya insulin siap dikemas dan dipasarkan.

Daftar Pustaka


Burrows, William. 1959. Textbook of Microbiology. Philadelphia: W. B. Saunders Company.

Cheatham, Bentley dan C. R. Khan., 1995. Insulin Action and the Insulin Signaling Network. Endocryn Society., p. 117-135.

Clark, David P, dan Lonnie D. Russell. 2000. Molecular Biology Made Simple and Fun. 2nd ed.  Vienna, IL: Cache River Press.

Esha, dkk.  2011. Pembuatan Insulin. http://www.slideshare.net/khairulhamidhamd/pembuatan-insulin.

Espinal, J., 1989. Understanding Insulin Action: Principles and Molecular Mechanisms. England: Ellis Hoorwood Limited.

Faridz, R., dkk. 2007. Analisis Jumlah Bakteri dan Keberadaan Escherichia coli pada Pengolahan Ikan Teri Nasi di PT. Kelola Mina Laut Unit Sumenep. EMBRYO Vol.4 No.2.

Godbey, W.T. 2014. An Introduction to Biotechnology 1st edition. New Orleans, USA: Academic Press.

Jawetz, dkk. 1995. Mikologi Kedokteran. Dalam: Mikrobiologi Kedokteran (20 ed.). Jakarta: EGC.

Kontributor Wikipedia, 'Galur', Wikipedia, Ensiklopedia Bebas, 6 Juni 2019, 03.58 UTC, <https://id.wikipedia.org/w/index.php?title=Galur&oldid=15149734> [diakses pada 6 Juni 2019]

Lanywati, Endang., 2001. Diabetes Mellitus Penyakit Kencing Manis. Yogyakarta: Kanisius.

Melliawati, R. 2009. Escherichia coli Dalam Kehidupan Manusia. Biotrends. 4 : 1

Old, R.W. dan Primrose, S.B., 1989. Prinsip-prinsip Manipulasi Gen: Pengantar Rekayasa Genetika. Australia : Blackwell Scientific Publications.

Panchangam, Sri Chandana. 2015. Escherichia Coli. 10.13140/RG.2.1.5159.9846.

Patel, S. Dutta, S. 2008. Global Health: Diabetes Mellitus: Drugs: Insulin: Insulin. doi: 10.2210/rcsb_pdb/GH/DM/drugs/Insulin/Insulin

Raudah, dkk,. 2017. Efektivitas Sterilisasi Metode Panas Kering pada Alat Medis Ruang Perawatan Luka Rumah Sakit Dr. H Soemarno Sostroatmodjo Kuala Kapuas. Banjar Baru: Jurnal Kesehatan Lingkungan. Vol 14. No. 1:  426.

Wilcox, Gisela. 2005. Insulin and Insulin Resistance. Clin Biochem., p. 19-31


Tidak ada komentar untuk "Pembuatan Insulin dengan Bakteri Escherichia Coli"