Produksi Enzim Protease dari Bakteri Bacillus subtilis


Definisi dan Kegunaan Enzim Protease

Protease adalah salah satu jenis enzim yang banyak digunakan dalam industri. Enzim protease merupakan salah satu biokatalisator yang berfungsi untuk memecah protein. Protease merupakan jenis enzim yang memiliki banyak variasi. Protease memiliki peranan penting dalam proses metabolisme dan keteraturan dalam sel. Pada dunia industri, protease sering digunakan dalam industri detergen, farmasi, kecantikan, makanan, film, dan pengolahan limbah. Berdasarkan pH optimumnya, protease dibedakan menjadi protease alkali, protease asam, dan protease netral.

Protease alkali atau protease serin adalah protease yang molekulnya stabil pada suhu tinggi dan aktivitasnya optimum pada pH 9-11. Protease asam adalah protease yang aktivitas optimumnya terjadi pada pH yang cukup rendah, yaitu 2-3. Protease ini jarang dijumpai pada bakteri, tetapi dapat ditemukan pada jamur. Protease asam banyak digunakan dalam industri kecap dan tahu. Protease netral sendiri adalah protease yang rentang pH optimumnya pada pH 6,6-7,6. Protease netral diproduksi oleh jamur dan bakteri.
Gambar 1. Aplikasi Enzim Protease dalam industri makanan sebagai pelunak daging.
Sumber: https://agscientific.com/blog/2018/11/protease-enzymes-applications
/

Sumber Enzim Protease

Enzim protease banyak terdapat pada bakteri proteolitik. Bakteri proteolitik adalah bakteri yang mampu menghidrolisis protein menjadi peptida yang lebih kecil atau sepenuhnya ke dalam unit asam amino. Studi ini dilakukan untuk menentukan aktivitas proteolitik Bacillus Sp. B1 terisolasi dari rhizosfer tanaman mustard. Aktivitas proteolitik enzim ditentukan berdasarkan jumlah tirosin dibebaskan di unit/mL, sementara aktivitas spesifik enzim yang ditunjukkan oleh aktivitas per satuan berat protein. Konsentrasi protein ekstrak enzim ditentukan oleh metode Lowry. Aktivitas enzim ditentukan pada berbagai waktu produksi (6, 12, 18, 24, 30, dan 36 jam). Hasilnya menunjukkan bahwa Bacillus Sp. B1 isolat mampu menghasilkan protease. Bacillus Sp. B1 mengisolasi diperoleh aktivitas maksimum dalam 30 jam waktu produksi. 

Aktivitas spesifik protease Bacillus Sp. B1 adalah 0, 2523 ± 0, 0050 unit/mg protein. Aktivitas enzim protease bisa dilihat dari berapa jumlah tirosin yang digunakan dalam satuan unit/ml, sedangkan untuk aktivitas dari spesifik enzim bisa ditentukan berdasarkan jumlah aktivitas per mg protein dalam ekstrak kasar. Metode Lowry bisa digunakan untuk menentukan konsentrasi protein. Aktivitas enzim biasanya dilihat pada rentang waktu produksi berkelipatan (6, 12, 18, 24, 30, dan 36 jam). Didapatkan hasil dalam penelitian yang menunjukan bahwa isolat Bacillus sp. B1 dapat menghasilkan enzim protease. Isolat Bacillus sp. B1 menampakkan bahwa aktivitas optimumnya pada saat waktu produksi 30 jam. Aktivitas spesifik dari enzim protease Bacillus sp. B1adalah 0,2523 ± 0,0050 unit/mg protein.

Karakteristik Bakteri Bacillus subtilis

Bacillus subtilis adalah bakteri gram-positif, katalase-positif, yang ditemukan di tanah dan saluran pencernaan manusia. Bakteri ini termasuk bagian dari genus Bacillus, B. subtilis berbentuk batang yang panjangnya 4-10 micrometer, diameternya 0,25-1 micrometer, memiliki flagella peritrichous (flagella di sekujur selnya) sehingga memudahkannya untuk bergerak didalam cairan dan dapat membentuk endospore yang tebal, memungkinkannya mentolerir kondisi lingkungan yang ekstrem terutama panas tinggi dan termasuk di luar angkasa, pada kondisi ekstrem dapat masuk ke fase dormant sampai 6 tahun. B. subtilis telah diklasifikasikan sebagai bakteri aerobik.

B. subtilis dianggap bakteri gram-positif paling banyak dipelajari dan model organisme untuk mempelajari replikasi kromosom bakteri dan diferensiasi sel. Bakteri ini sering digunakan dalam produksi enzim dan antibiotik. Dapat bertahan pada lingkungan bersuhu -5°C sampai 75°C dengan pH dari 2 sampai 8. Waktu penggandaannya adalah 28,5 menit pada suhu 40°C. Untuk pengembangbiakkan nutrisinya didapat salah satunya dari tanaman mati, sehingga sering ditemukan di tanah. Bakteri ini mudah dimanipulasi secara genetika dan sederhana dibiakkan sehingga banyak digunakan pada skala industri oleh perusahaan-perusahaan bioteknologi.

Proses Produksi

Raw Material

Dalam memproduksi enzim protease, mikroorganisme sering digunakan sebagai media untuk menghasilkan enzim tersebut. Salah satu mikroorganisme yang digunakan adalah bakteri Bacillus subtilis. Produksi enzim protease dengan menggunakan bakteri Bacillus subtilis dipengaruhi oleh kondisi dari bioreaktor yang digunakan seperti suhu, pH, sistem aerasi, air, kelembaban, dan substrat. Hal yang harus diperhatikan apabila melakukan proses produksi di skala industri, keadaan pertumbuhan mikroorganisme yang baik bukan berarti akan menghasilkan enzim protease yang tinggi pula. Ada beberapa hal yang perlu diperhatikan agar hasil produksi enzim protease dari bakteri Bacillus subtilis (Nathiele Contrera, 2019).

Proses Upstream

Sebelum melakukan penelitian mikrobiologi, kita perlu mempersiapkan beberapa hal, diantaranya adalah sterilisasi dan pembuatan media biakan.

Sterilisasi

Sterilisasi adalah suatu usaha untuk membebaskan bahan atau alat dari semua kehidupan terutama mikroba. Ini sangat penting untuk menghindari terjadinya kontaminasi oleh mikroorganisme lain, sehingga tidak mengganggu mikroorganisme lain yang digunakan dalam penelitian ini. Beberapa cara sterilisasi yang dapat digunakan adalah :
  1. Sterilisasi dengan pemijaran, digunakan untuk sterilisasi alat-alat dari logam seperti jarum ose dan jarum platina. Alat-alat dari logam dibakar sampai pijar pada lampu spirtus atau lampu Bunsen.
  2. Sterilisasi dengan udara kering, menggunakan alat yang disebut “hot air sterilizer” (oven). Alat sterilisasi ini biasanya digunakan untuk mensterilisasi alat-alat gelas seperti Erlenmeyer, petri dish, tabung reaksi dan alat-alat gelas lain. Bahan-bahan seperti kapas, kain dan kertas juga dapat disterilkan dengan alat ini dalam batas tertentu. Temperatur yang digunakan pada sterilisasi ini adalah 1700°C -1800°C selama paling sedikit 2 jam. Perhitungan waktu dimulai setelah temperatur mencapai 1700C, dan sterilisasi diakhiri setelah minimal 2 jam. Perlu diperhatikan bahwa lama sterilisasi tergantung jumlah alat yang disterilkan dan ketahanan alat atau bahan terhadap panas.
  3. Sterilsasi dengan uap air panas bertekanan, menggunakan alat yang disebut autoclave. Alat ini tersusun atas suatu bejana tahan tekanan tinggi yang dilengkapi dengan manometer, termometer dan klep bahaya. Bahan-bahan yang disterilkan dengan cara ini adalah bahan yang mengandung cairan, tahan terhadap hidrolisis. Waktu yang dibutuhkan untuk sterilisasi minimal 15-30 menit dengan tekanan 2 atm dan temperatur 1210°C. (Balia, 2002).

Pembuatan Media Biakan

Media biakan adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran nutrisi atau makanan yang dipakai untuk menumbuhkan mikroba. Selain untuk menumbuhkan mikroba, media padat digunakan pula untuk isolasi, memperbanyak mikroba, pengujian sifat-sifat fisiologis dan perhitungan jumlah mikroba (Naiola, et al. 2007). Media yang baik adalah media yang di dalamnya terkandung semua yang dibutuhkan bakteri untuk tumbuh kembangnya. Media mengandung semua nutrisi yang mudah digunakan oleh mikroba, mempunyai tekanan osmosis, tegangan permukaan dan pH yang sesuai, tidak mengandung zat-zat penghambat pertumbuhan mikroba serta harus steril (Guangrong, et al. 2006).

Proses Downstream

Fermentasi

Dalam proses produksi protease dengan menggunakan bakteri Bacillus subtilis, terdapat dua jenis proses fermentasi yang digunakan, yaitu proses Submerged Fermentation (SmF) dan proses Solid-state Fermentation (SSF). Proses Submerged Fermentation banyak digunakan dalam industri enzim. Dalam proses ini jenis substrat yang digunakan berada dalam fase cair. Substrat padat yang digunakan seperti sukrosa, dekstrosa/glukosa, pepton, ekstrak jamur, dan garam dilarutkan terlebih dahulu. Sedangkan substrat cair dapat digunakan gula tebu (fase cair) dan kaldu. Proses Submerged Fermentation cocok dilakukan disebabkan kebutuhan cairan untuk bakteri dapat dengan mudah terpenuhi. Keuntungan dari proses ini adalah mudah dikontrolnya pertumbuhan dari bakteri dan pegambilan enzim dari bakteri. Namun, proses Submerged Fermentation memiliki beberapa kelemahan, yaitu biaya yang cukup mahal hingga hasil yang diperoleh tidaklah begitu besar.

Proses fermentasi kedua yang dapat digunakan adalah Solid-state Fermentation. Proses ini menggunakan jenis substrat dalam fasa padat. Substrat yang digunakan dalam proses ini adalah dedak gandum, ampas tebu, limbah buah dan sayuran, jerami, dan bubur kertas. Dibandingkan dengan proses Submerged Fermentation, proses Solid-state Fermentation memiliki beberapa kelebihan, diantaranya adalah proses yang lebih sederhana, hasil enzim yang diperoleh lebih besar dan stabil, proses sterilisasi yang cukup mudah dikarenakan penggunaan air yang cukup rendah dan penggunaan limbah agroindustri sebagai substrat. Agar hasil fermentasi yang diperoleh optimal, diperlukan sumber karbohidrat, protein, dan mineral yang dibutuhkan untuk pertumbuhan bakteri Bacillus subtilis tercukupi. Hal tersebut dapat dilakukan dengan memanipulasi substrat agar kebutuhan bakteri tersebut terpenuhi.

Purifikasi

Proses purifikasi perlu dilakukan agar enzim protease yang dihasilkan oleh bakteri dapat dipisahkan dengan substrat dan bakteri. Proses purifikasi ini biasanya melibatkan beberapa metode yang mana tergantung pada ukuran, biaya, sifat hidrofilik dan hidrofobik, dan kemampuan untuk mengikatsenyawa tertentu. Pemurnian protease biasanya dapat dilakukan dengan presipitasi menggunakan pelarut organik atau garam dan proses kromatografi. Presipitasi sering digunakan dalam proses downstream. Proses presipitasi dapat melibatkan pembentukan amorf dalam fase padat. Hal ini dapat dilakukan dengan memodifikasi perubahan pH, suhu, atau dengan dengan penambahan garam, pelarut organic atau polimer. Teknik presipitasi melibat dua hal penting yaitu konsentrasi dan pemurnian biomolekul yang diharapkan. Beberapa cara presipitasi yang dapat digunakan diantara lain adalah:
  1. Penambahan pelarut organik. Pelarut organik yang penting untuk digunakan dalam proses presipitasi ini adalah metanol, etanol, isopropanol, dan aseton. Pada presipitasi dengan penambahan pelarut organik disebabkan oleh penurunan konstanta dielektrik dalam larutan. Penurunan ini dapat memicu peningkatan interaksi elektrostatik pada bagian protein yang memiliki muatan berlawanan yang memungkinkan terjadinya agregasi dan pengendapan. Endapan yang terbentuk dikarenakan penambahan pelarut organik memiliki stabilitas yang lebih tinggi apabila direndam dalam larutan.
  2. Penambahan larutan garam. Pada saat garam ditambahkan ke dalam larutan, maka garam akan terdisosiasi dan akan membentuk interaksi ion serta menciptakan adanya interaksi elektrostatik pada muatan residu di permukaan protein. Interaksi non-polar dimungkinkan untuk terjadi antara bagian hidrofobik dari garam organic dengan residu hidrofobik pada biomolekul. Pada konsentrasi yang tinggi, ion akan menyerap molekul air di sekitar protein, mengekspos residu protein, menurunkan kelarutan dan mengendapkan protein. Amonium Sulfat (NH4)2SO4 biasanya digunakan untuk proses presipitasi garam dan biasanya diterapkan dalam pemurnian enzim dikarenakan cara kerjanya yang sederhana dan tidak dihasilkannya panas serta kelarutan dan non-denaturasi yang tiggi. Namun dikarenakan ammonium sulfat bersifat korosif, maka proses pembuangan limbah harus lebih dikontrol. Larutan enzimatik yang diperoleh perlu dilakukan proses pendinginan pada suhu 4-5 oC untuk menghindari denaturasi enzim selama proses pengendapan.

Distribusi

Setelah proses purifikasi dilakukan, maka akan diperoleh enzim protease yang diinginkan, maka proses distribusi enzim protease dapat dilakukan ke industri-industri yang membutuhkan. Industri-industri yang banyak menggunakan enzim protease adalah industri detergen, farmasi, kecantikan, makanan, film, dan pengolahan limbah.

Bagan Proses Produksi Overall

Skema Proses Produksi Enzim Protease dari Bakteri Bacillus subtilis.
Gambar 2. Skema Proses Produksi Enzim Protease dari Bakteri Bacillus subtilis.

Daftar Pustaka

Ace Baehaki, dkk.2011. Isolasi dan Karakterisasi Protease dari Bakteri Tanah Rawa Indralaya Sumatera Selatan. Jurnal Teknologi Pangan dan Industri. 22(1): 40-45.

Anthoni Agustine, dkk. 2010. Produksi Protease Alkali dan Keratinase Dari Brevibacillus agri A-03 Termofilik. Jurnal Riset Kimia. 4(1): 7-14.

Atik Zaidatul Maziah. 2009. Produksi dan Karakterisasi Protease Isolat Bakteri Termofilik dari Sumber Air Panas Plantungan-Kendal. Skripsi. Semarang: Universitas Negeri Semarang.

Borkar, Prita S. 2018. Purification and Immobilization of Thermostable Serine Alkaline Protease from Bacillus subtilis. The Pharma Innovation Journal. 7(5):622-626.

Gimenes, Nathalie Contrea, et.al. An Overview of Protease: Production, Downstream Processes and Industrial Applications. Journal Separation and Purification. 2019. 00, 1-21, DOI: 10.1080/15422119.2019.1677249.

Nurasiah Djaenuddin dan Amran Muis. 2015. Karakteristik Bakteri Antagonis Bacillus subtilis dan Potensinya Sebagai Agens Pengendali Hayati Penyakit Tanaman. Makalah.

Putri Ramadhani, dkk. 2015. Produksi Enzim Protease Dari A.niger PAM18A dengan Variasi pH dan Waktu Inkubasi. Jurnal Biologi. 4(2): 25-34.

Tidak ada komentar untuk "Produksi Enzim Protease dari Bakteri Bacillus subtilis"